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　　(CRC) 在全球癌症相关死亡率方面排名第二，约 50% 的 CRC 死亡是由肝转移引起的，肿瘤细胞与肿瘤微环境（TME）之间的相互作用在结直肠癌肝转移（CRLM）中发挥着重要作用。在 CRLM 期间，癌细胞可以通过重塑 TME 来诱导转移前生态位的形成。据报道，活化的肝星状细胞 (α-HSC) 特征被发现是继发性或原发性肝癌中最常见的生物学过程，α-HSCs 可以从静止状态转分化为高度增殖和移动的肌成纤维细胞。此外，α-HSCs 可以通过重塑和沉积细胞外基质 (ECM) 来影响 CRC细胞的生长和侵袭。目前细胞外囊泡 (EVs) 以其脂质双层膜和携带许多生物分子的特点，通常被认为是参与 TME 中细胞间通讯的信使，并已被证明在几种癌症的进展中发挥重要作用。因此，探索 CRC 细胞和 HSCs 之间的相互作用，以及CRC衍生的EVs是否通过分泌富含miRNA的EVs调节HSCs以诱导肝转移机制尤为重要。

　　本研究通过miRNA芯片技术对高度转移性CRC细胞分泌的细胞外囊泡RNA进行检测，发现高度转移性CRC细胞比表现出低转移潜能的细胞释放更多富含 miR-181a-5p 的细胞外囊泡促进了 CRLM。此外，该研究验证了 FUS 介导 miR-181a-5p 包装入 CRC EVs，从而通过靶向 SOCS3 和激活 IL6/STAT3 信号通路来激活肝星状细胞 (HSC)。活化的 HSC通过分泌趋化因子 CCL20，进一步激活 CCL20/CCR6/ERK1/2/Elk-1/miR-181a-5p 正反馈回路，导致 TME 重塑和 CRLM 中转移前微环境的形成。临床上，含有高表达miR-181a-5p 的血清 EVs 与 CRC 患者的肝转移呈正相关。总之，富含 miR-181a-5p 的高度转移性 CRC 细胞衍生的 EVs 可以激活 HSC 并重塑 TME，从而促进 CRC 患者的肝转移。这些结果为CRC肝转移的潜在机制提供了新的见解。

　　在转移性肝癌的转移前生态位的形成过程中，慢性肝脏炎症是常见的，所以，作者又检测了CRC 衍生的 EVs 刺激后肝星状细胞中促炎基因的表达水平, 发现高转移性 CRC 细胞的 EVs 共培养的肝星状细胞表达的 IL-6、IL-8、COL1A1、COL3A1 和 COL4A1（尤其是 IL-6）的 mRNA 水平更高。此外，在小鼠中注射来自高转移性 CRC 细胞的EVs 后检测到更多的肝转移以及重塑了肝脏 ECM（图 1 g-j）。

　　为了进一步探索 CRC 细胞衍生的 EVs miR-181a-5p 在 CRLM 期间参与激活 HSCs 的机制，进行了 GO/KEGG 富集分析（表S7，S8）。通过数据库分析表明，miR-181a-5p 序列可以比对上细胞因子信号 3 抑制因子 (SOCS3) 序列的 3-UTR（图 4a）。通过双荧光素酶实验、qPCR和WB实验证明了 SOCS3 是miR-181a-5p的靶基因（图 4b-d）。通过挽救实验证明了miRNA可以通过抑制靶基因来发挥促进侵袭和激活IL6/STAT3 信号通路的功能（图 4f-h）。同时，使用过表达或抑制miR-181a-5p的EVs处理靶细胞，也有相同的表型（图4e、4j-k）。

　　通过体外 Transwell 测定，证明外源性 miR-181a-5p 可以显著促进 CRC 细胞的迁移和侵袭（图 5a-b）。此外，体外 Transwell 测定（图 5c-d）和体内肝转移小鼠模型（图 5e-g) 都表明，由 CRC 细胞衍生的 EVs miR-181a-5p 激活的 α-HSCs 反过来也促进了 CRC 细胞迁移、侵袭和转移性肿瘤集落在肝脏中的形成。随后，使用 WB 分析和 IHC 染色进一步检查了小鼠肝脏转移灶中 ECM 成分的表达，结果表明CRC细胞衍生的EVs miR-181a-5p通过增加α-SMA和纤连蛋白的表达，同时降低玻连蛋白和生腱蛋白C的表达，重塑了肝脏ECM（图 5h）。因此，这些表明 CRC 细胞衍生的 EVs miR-181a-5p 可以重塑 CRLM 期间的转移前生态位。

　　由于α-HSC可能分泌包括趋化因子在内的促炎信号来调节TME和癌症进展，所以研究者通过人类趋化因子筛选检测试剂盒，检测了与 RKO 细胞衍生的 EVs 或阴性对照预培养的肝星状细胞中的趋化因子水平，并通过定量和挽救实验验证了CCL20是受miR-181a-5p调节最明显的趋化因子（图 6a-c）。此外，CCL20的受体 CCR6 蛋白在CRC 组织中的表达也明显强于正常组织（图 6d），表明 LX2细胞分泌的CCL20可能对CRC细胞发挥作用。

　　最后，为了进一步证实 CRLM 中 miR-181a-5p 表达的临床意义，作者对结直肠癌组织、患者血清外泌体中的miR-181a-5p表达进行了检测，发现III-IV期肿瘤中miR-181a-5p的表达显著高于I-II期的肿瘤组织（图8a），肝转移患者血清EVs中miR-181a-5p的表达水平高于无转移的患者（图8b）。此外，miR-181a-5p表达较高的CRLM患者也表现出更高的CEA和α-SMA表达（图 8e）。CRLM 患者肿瘤组织中miR-181a-5p高表达，预示着预后较差（图 8f-g )。综上所述，这些结果表明CRC衍生的EVs miR-181a-5p在CRC的进展中起着关键作用，尤其是在结直肠癌肝转移中。